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    Ⅱ級生物安全柜防護性能檢測與評價

    時間:2018-09-07 16:54 來源:蘇州凈化 作者:蘇凈生物安全柜
      生物安全柜是保證實驗室生物安全的重要防護 設施,可以提供對人員、產品、環境的保護。省疾病 預防控制中心生物實驗室擔負著項目繁多、種類復 雜的檢品,檢驗人員的防護措施主要靠生物安全柜。 為了解生物安全柜的防護性能,我們以本中心實驗 室引進的美國LABCONCO 型Ⅱ級B1 型生物安柜為 代表,對其生物因子防護性能進行了檢測和評價。 現將檢測結果報告如下。

      1 材料與方法

      1. 1 試驗材料 實驗設備為 LABCONCO 型Ⅱ級 B1 型生物安全柜,為美國進口產品,位于本中心微生物實驗室。 主要試驗儀器有 TK -2 氣溶膠發生器、安德森二級采樣器、 AGI 液體撞擊式采樣器、熱球式風速 儀、聲級計、照度計和氣流檢查器等。 試驗指標菌為枯草桿菌黑色變種( ATCC 9372) 芽孢,由軍事醫學科學院消毒檢測中心提供;采用胰 酶大豆瓊脂培養基和胰酶大豆液體培養基,均為國 內市售產品。 模擬手臂所用的不銹鋼圓筒是按照標準規定的 試驗方法自行設計制作。


    Ⅱ級生物安全柜防護性能檢測與評價
     

      1. 2 試驗方法

      1. 2. 1 氣溶膠發生液的制備 將枯草桿菌黑色變 種菌種接種于胰酶大豆瓊脂培養基平板劃線分離培 養后,挑取典型菌落接種于胰酶大豆營養肉湯培養 基中,于37℃ 培養24 h。取培養物均勻涂布于羅氏 瓶中營養瓊脂培養基表面,置 37℃培養 7 d ,經細 菌芽孢染色鏡檢,確認芽孢形成率 > 95% 時,收 取芽孢。將新收取芽孢懸液用雙層脫脂紗布過濾, 3 000 r/min 離心 10 min,PBS 緩沖液反復清洗 3次; 滅活繁殖體,梯度稀釋,活菌計數即成芽孢懸 液, 4℃保存備用。

      1. 2. 2 環境本底采樣 在對安全柜作測試前,先對 實驗室環境和安全柜進行清潔消毒,再用安德森二 級采樣器對生物安全柜所在實驗室環境本底進行采 樣,以確定測試環境中是否含有與試驗菌相同的細 菌。采樣流量 28. 3 L/ min,采樣 15 min,對采樣平 板進行培養,觀察和鑒定。

      1. 2. 3 人員保護測試 ① 調整好安全柜內氣流: 將安全柜內氣流速度設置為規定的標準值,讓安全 柜處于工作狀態。② 發生氣溶膠:在 TK -2 氣溶膠 發生器裝入含菌量為 6. 5 × 108 /ml 的芽孢懸液 20 ml,置于安全柜內兩側壁之間,發生器噴嘴前端在前 窗操作口內 10 cm,其軸線在工作臺面上方36 cm 處,以流量為7. 5 L/min,噴射方向平行于工作臺面 且正對前窗操作口進行噴霧染菌。③ 采樣: 將外徑 為6. 3 cm 的不銹鋼圓筒固定在安全柜工作臺面上 中心位置,一端貼于安全柜的后壁,另一端從安全柜 的前窗操作口伸出安全柜至少15 cm,圓筒軸線距 工作臺面7 cm;將6 個 AGI 液體撞擊式采樣器呈左 右對稱放置在安全柜前,采樣口正對安全柜; 其中 2 個采樣器的采樣口軸線相距15 cm、與圓筒上沿平 齊,另2 個采樣器采樣口軸線相距5 cm、位于圓筒 下沿3 cm 的水平面上,采樣口前端距安全柜均為 6. 3 cm; 然后 2 個采樣器的采樣口水平面在工作臺 面上方36 cm 處,采樣口前端距安全柜5 cm,采樣口 軸線距安全柜中線 15 cm;所有采樣器的流量均以 12. 0 L/min 進行采樣。將陽性對照瓊脂培養基平 板布放在圓筒下,位于前窗進氣格柵上方1 cm,作 沉降采樣。④ 安德森采樣器采樣:將2 個安德森二 級采樣器的采樣口平面與安全柜工作臺面平齊,采 樣口的垂直軸線在安全柜前方15 cm 處,各距側壁 20 cm;以采樣器流量為 28. 3 L/min 進行采樣。⑤ 測試順序:首先啟動安德森二級采樣器采樣, 5 min 后,再啟動 TK - 2 氣溶膠發生器,共噴霧染菌 6. 5 min; 第 6 min 啟動 AGI 液體撞擊采樣器,采樣5 min;30 min 后停止安德森二級采樣器采樣。⑥ 培 養:對 AGI 液體撞擊采樣器的采樣液用一直徑為 4. 7 mm、孔徑0. 22 μm 濾膜進行過濾,取出濾膜置 于合適的培養基平板上;將貼有撞擊采樣器采樣液 濾膜的平板、安德森采樣器采樣的平板以及各種對 照平板,均置于37℃培養 24 ~ 28 h 觀察結果,進行 細菌查計數;試驗重復3 次。⑦結果判定:平板上枯 草桿菌黑色變種芽孢生長數限制值符合以下條件判 定為合格:所有撞擊采樣器采樣液濾膜平板上菌數 應≤10 cfu,安德森采樣器采樣平板上菌數應≤5cfu,陽性對照平板上菌數應 > 300 cfu。試驗重復 3 次,均符合要求。

      1. 2. 4 產品保護測試 ①調整好安全柜內氣流: 將安全柜內氣流速度設置為規定的標準值,讓安全 柜處理工作狀態。②采樣準備:在安全柜的工作臺 面上排滿敞開的營養瓊脂培養基平板50 個。將外 徑為 6. 3 cm 圓筒固定在安全柜工作臺面上的中心 區,一端貼住工作區的后壁,另一端從前窗操作口伸 出安全柜至少 15 cm,圓筒的軸線高于工作臺面7 cm;將1 個陽性對照培養基平板放在圓筒下,位于 前窗進氣格柵上方1 cm。③ 發生氣溶膠:在 TK -2 氣溶膠發生器裝入含菌量為6. 5 ×106 /ml 的芽孢懸 液20 ml,安放在安全柜外,噴射軸在安全柜中心并 與前窗操作口上沿平齊,噴嘴前端位于前窗操作口 外10 cm,噴霧方向平行于工作臺面,正對前窗操作 口;啟動 TK - 2 氣溶膠發生器,流量為 7. 5 L/min, 噴霧5 min 后關閉。④ 采樣:讓所有打開的培養基 平板自然沉降10min,立即蓋上平板蓋,置于37℃培 養24 ~48 h 觀察結果,進行菌落計數。試驗重復 3 次。⑤ 結果判定:所有柜內實驗組采樣平板上的枯 草桿菌黑色變種芽孢菌數之和應≤5 cfu,陽性對照 采樣平板上菌數應 > 300 cfu,即可判定為合格。試 驗重復3 次,均符合要求。

      1. 2. 5 交叉污染保護測試 ① 調整好安全柜內氣 流:將安全柜內氣流速度設置為規定的標準值,讓安 全柜處于工作狀態。② 氣溶膠染菌準備: 在 TK -2 氣溶膠發生器裝入含菌量為6. 5 ×104 /ml 的芽孢懸 液20 ml,置于安全柜內,緊靠左側內壁的中心,噴 射軸線在工作臺面上 12 cm 處,噴射方向平行于工 作臺面正對面的側壁。③ 布放采樣平板: 將敞開的 瓊脂培養皿從前至后排列在工作臺面上:2 排對照 培養皿位于 TK -2 氣溶膠發生器噴嘴下方;距噴霧 器所在側壁 36 cm 處放 1 排培養皿; 距噴霧器所在 側壁36cm 外放2 排培養皿。④ 開啟TK -2 氣溶膠 發生器,以流量 7. 5 L/min,噴霧5 min 后關閉;自然 沉降20 min 采樣,蓋上平板蓋。將所有采樣平板置 于37℃培養24 ~28 h 觀察結果,進行菌落計數。⑤ 另一側重復:將噴霧器放于靠右側內壁中央執行上 述步驟。⑥ 結果判定:距被檢測側壁 36 cm 外的采 樣平板上枯草桿菌黑色變種芽孢菌數之和應≤2 cfu;距被檢測側壁36 cm 內的采樣平板( 陽性對照) 的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數之和 > 300 cfu,即可 判定合格。安全柜的左右側均各重復試驗3 次,每 次試驗結果均符合要求。

      1. 2. 6 下降氣流流速測試 在工作區上方高于前 窗操作口上沿10 cm 的水平面上方呈等距離安排測量點,形成15cm ×15cm 的正方形柵格,測試點至少 應有3 排,每排 7 個測量點。測試區域邊界與安全 柜的內壁及前窗操作口的距離應為15 cm。用風速 計探針準確定位在各測量點進行測量,記錄各測量 值并計算平均值。結果判定:下降氣流流速在0. 25 ~0. 5 m/s 之間為合格。

      1. 2. 7 流入氣流流速測試 用風速計在前窗操作 口平面測量兩排各點的氣流流速,第一排在前窗操 作口上沿下1/4 開口高度位置;第二排在前窗操作 口上沿下約3/4 開口高度位置; 測量點間隔 10 cm, 距前窗操作口的側邊不少于10 cm,計算各測量值 的平均值。結果判定: Ⅱ級 B1 型安全柜流入氣流 平均流速應≥0. 5 m/s。

      1. 2. 8 氣流煙霧模式測試 ①下降氣流測試: 煙 霧沿著工作表面的中心線,在前窗操作口頂端以上 10 cm 的高度,從安全柜的一端到另一端。②觀察 窗氣流測試: 煙在觀察屏后 2. 5 cm、前窗操作口頂 端以上15 cm 高度從安全柜的一端到另一端; ③前 窗操作口邊緣氣流測試:煙在安全柜外大約3. 8 cm 處沿著整個前窗操作口的周界經過,特別應注意角 落和垂直邊緣。④滑動窗密閉性測試:煙在滑動窗 內從距安全柜側壁 5 cm 處沿工作區上沿經過。⑤ 結果判定: A. 下降氣流和觀察窗氣流:工作區內的 氣流應向下,不產生旋渦和向上氣流且無死點,氣流 不從安全柜中逸出。B. 前窗操作口邊緣氣流氣流: 應不從安全柜中溢出。C. 滑動窗密閉性: 前窗操作 口整個周邊氣流應向內,無向外逸出的氣流。前窗 操作口流入氣流應不進入工作區。

      1. 2. 9 噪聲測試 ①打開安全柜的風機和照明燈, 在安全柜前壁中心水平向外30 cm、工作臺面上方 38 cm 處測量噪聲。②關閉安全柜的風機和照明 燈,在相同位置測量背景噪聲; ③當背景噪聲大于 57 dB( A) 時,實測值按規定進行修正。④結果判 定: ≤67 dB( A) 。 1. 2. 10 照度測試 在工作臺面上,沿工作臺面兩 內側壁中心連線布點,測量點之間距離不超過 30 cm,與側壁較小距離為 15 cm;關掉安全柜的燈,從 一側起依次在測量點進行背景照度測量。打開燈、 啟動風機,從一側起依次測量臺面照度。結果判定: 平均照度≥650 lx,較低照度≥430 lx。

      2 結果

      2. 1 環境本底采樣測試結果 經安德森二級采樣器對安全柜所在環境進行的 采樣,所有平板上沒有枯草桿菌黑色變種芽孢生長。

      2. 2 人員保護測試結果

      3 次試驗結果表明,所有 AGI 液體撞擊采樣器 采樣液接種的平板上生長的枯草桿菌黑色變種芽孢 菌數均符合≤10 cfu/皿,安德森采樣器采樣平板上 生長的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數均≤5 cfu/皿,陽 性對照平板上枯草桿菌黑色變種芽孢菌數 > 300 cfu/皿的標準要求( 表 1) 。

      2. 3 產品保護測試結果 連續 3 次試驗,在生物安全柜外人工發生氣溶 膠,布放在安全柜內工作臺面上的共50 個采樣平板 上采集到的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數之和分別為 3、 1、 2 cfu,均符合≤5 cfu 的標準要求; 陽性對照平 板上生長的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數分別為 315、 335、 360 cfu/皿,均符合 > 300 cfu/皿的標準要 求( 表2) 。

      2. 4 交叉污染保護測試結果 3 次測試結果表明,經左右兩側向對面攻擊方 向噴霧細菌氣溶膠,在距被檢測側壁 36 cm 外的10 個采樣平板上采集到的枯草桿菌黑色變種芽孢菌數 之和均≤2 cfu/皿;從試驗側壁到距此側壁36 cm 范 圍內的3 排15 個陽性對照采樣平板上采集到的枯 草桿菌黑色變種芽孢菌數之和均 >300 cfu/皿,結果 符合標準規定要求( 表3) 。

      2. 5 物理防護性能檢測結果

      經用不同儀器監測結果證明,該生物安全柜啟 動運行條件下,流入氣流流速、下降氣流流速、氣流 煙霧模式、噪聲和照度等物理防護性能指標符合相 關標準的規定( 表4) 。

      3 討論 目前,國內尚未出臺生物安全柜的國家標準,國 內大多數生物安全柜都未能進行防護性能檢測。 2006 年頒布實施的中國醫藥行業標準 YY0569 - 2005《生物安全柜》 〔1〕,是在參考美國標準 NSF49 - 2002〔2〕和歐洲標準 EN12469 - 2000〔3〕基礎上制定, 其適用性有待大量檢測與科學驗證,以便更適合本 國國情。本次依照現有標準,對本中心已經使用 3 年時間的美國進口 LABCONCOⅡ級 B1 型生物安全 柜進行了人員保護、產品保護、交叉污染保護等生物 防護性能和氣流煙霧模式、下降氣流流速、流入氣流 流速、噪聲、照度等物理防護性能指標進行了檢測。 檢測結果證明,該生物安全柜生物和物理防護性能 都符合標準要求,與出廠時檢測的結果一致,說明我 國行業標準 YY0569 -2005 檢測方法具有較好的靈 敏性、可重復性和適用性。 人員保護測試布點都是設在安全柜氣流屏障薄弱的位置,檢測結果具有較好的代表性。由于在 安全柜內實驗操作時,手臂能干擾氣流,因此,四個 AGI 液體采樣器采樣點設在模擬手臂擺放的位置;上方的兩個 AGI 液體采樣器設在模擬人員操作時 口鼻所處位置,而 A GI 采樣器結構亦設在模擬人員 呼吸的自然通氣量和呼吸道生理曲度。Ⅱ級生物安 全柜的兩側前窗滑軌處容易引起氣流紊亂,是氣幕 屏障的另一個薄弱環節,因此在此處選用的兩個安 德森采樣器進行30 min 空氣微生物采樣,能靈敏地 監測外逸的氣溶膠細菌含量。 因枯草桿菌黑色變種芽孢抗力強,國外 NSF49 -2002 和 EN12469 - 2000 兩大生物安全柜標準都 將其作為生物安全柜生物防護性能檢測的指示菌 株,但其制備較費時,且難以消毒,不利于儀器設備 的周轉,不適宜現場連續檢測工作;若環境中殘留的 細菌芽孢消毒不徹底,容易造成后續檢測的假陽性。 因此,選擇易消毒、自然空氣中的非優勢菌株來代替 枯草桿菌黑色變種芽孢作為指示菌株,有待進一步 研究〔4〕。 另外,該行業標準中尚缺生物安全柜高效排風 過濾器生物氣溶膠泄露的標準檢測方法;而用風速 儀法測流入氣流流速時,其采樣方法需依據安全柜 分型不同而異,如 B2 型因排風管密閉根本無法測 量,因此,我國醫藥行業標準 YY0569 -2005 在一些 項目的檢測方法上有待進一步完善。

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